Akcja Assassin’s Creed II rozgrywa się w renesansowych Włoszech i Wenecji (dokładniej w Republice Florenckiej i Republice Weneckiej), zaś głównym bohaterem jest Ezio Auditore da Firenze. W grze pojawia się młody Leonardo da Vinci, dzięki któremu Ezio zyskuje nową broń i gadżety, które może wykorzystać w walce, w pewnym momencie zyskuje również możliwość skorzystania z zaprojektowanej przez niego lotni. Dostępnych jest także kilka nowych rodzajów broni: topór, młot, buława, włócznie, dwa rodzaje mieczy, halabarda oraz dwa mniejsze ostrza[8]. Chociaż Ezio nie może nosić ze sobą części broni, potrafi odebrać je przeciwnikom i wykorzystać w walce.