Głównym bohaterem gry jest Ezio Auditore da Firenze, młody szlachcic z bogatej florenckiej rodziny. Podobnie jak Altaïr ibn al-Ahad z pierwszej części gry, jest on praprzodkiem Desmonda Milesa, asasyna przetrzymywanego przez korporację Abstergo Industries[10]. Fabuła rozpoczyna się we współczesności, kiedy Desmond i Lucy Stillman uciekają z Abstergo do kryjówki, gdzie spotykają się z innymi współczesnymi asasynami, Shaunem i Rebeką. W kryjówce Desmond korzysta z ulepszonej wersji animusa i przeżywa wspomnienia swojego przodka.
Ezio żyje w dostatku. Ma dwóch braci, starszego Frederica i młodszego Petruccia, siostrę Claudię, matkę Marię oraz ojca Giovaniego. Sytuacja zmienia się diametralnie, kiedy jego ojciec zostaje zdradzony i niesłusznie oskarżony, wrzucony do więzienia, a później stracony razem poprzez powieszenie z Frederikiem i Petrucciem. Wrogowie rodziny wciąż polują na Auditorów, więc Ezio decyduje się zabrać matkę i siostrę do Monteriggioni do swojego wuja Mario. Tam dowiaduje się, że jego ojciec był asasynem i rozpoczyna planowanie zemsty na sprawcach jego tragedii. Z czasem odkrywa, że intryga sięga znacznie głębiej – zaangażowany w nią jest zakon templariuszy, do którego należą m.in. jego wróg Vieri de’ Pazzi i jego ojciec oraz tajemniczy Hiszpan, a sprawa dotyczy m.in. zamachu na Lorenza de’ Medici i Fragmentu Edenu.
Akcja rozgrywa się w latach 1476-1499[11], 295 lat po wydarzeniach przedstawionych w pierwszej części[8]. W Assassin’s Creed II ponownie pojawiają się postaci historyczne, tym razem są to rodzina Pazzich, Leonardo da Vinci, Niccolò Machiavelli, Caterina Sforza, Lorenzo de’ Medici, Girolamo Savonarola i Rodrigo Borgia[8].
Lokacje, które odwiedza bohater, to Florencja, toskańska wieś, willa rodu Auditorów w Monteriggioni, Wenecja, zamek Forlì oraz Rzym (głównie Watykan)[8]. Wśród odwzorowanych lokacji znajdują się m.in. bazylika św. Marka w Wenecji, nieskończona jeszcze katedra Santa Maria del Fiore, kanał Grande, most Rialto oraz wenecki Pałac Dożów[8].
Ubisoft stworzył również trzyodcinkowy serial Assassin’s Creed: Rodowód, przedstawiający historię poprzedzającą wydarzenia z gry[12]. Wszystkie odcinki można obejrzeć na stronie głównej gry[13].
